Polar MC-IMAC 填料是一种金属亲和填料,适用于纯化带有组氨酸 ( His ) 标签的重组蛋白，这类重组蛋白广泛应用于生物技术领域。该填料以亲水性聚甲基丙烯酸酯微球为基质，粒径为 30 μm 或 60 μm,孔径为 800 Å，具有较高的物理和化学稳定性。填料表面具 有高度的亲水性,最大程度地避免了与生物类样品的非特异性吸附。在亲水性表面,以专有连接物链接了能螯合多价金属离子的羧酸基团。
Polar MC-IMAC 填料有两种类型 : 游离酸型(Polar MC30-CA Excel 或 Polar MC60-CA Excel，羧酸 ) 和螯合镍离子型 ( Polar MC30-Ni Excel 或Polar MC60-NiExcel)。游离酸型可用于金属离子去除,也可根据客户要求定制他金属离子型填料。这两种类 型的 IMAC 填料结构如图 1 所示。
该填料高度稳定,可耐受 0.5 M NaOH 接近 100次清洗循环。螯合金属离子的填料能在 0.1 M 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的清洗条件下不损失金属离子,因此每次使用后无需再补充金属离子。这两种填料都可以散装、 FPLC 柱或常规 HPLC 柱的形式提供。
| 填料类型 | Polar MC30-CA Excel, Polar MC30-Ni Excel Polar MC60-CA Excel, Polar MC60-Ni Excel |
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|---|---|---|
| 包装条件 | 50%（v/v）悬浮液，在20%乙醇中保存 | |
| 基体 | 亲水性聚甲基丙烯酸酯 | |
| 粒径 | 20 ~ 45 μm (平均30 μm) 45 ~ 90 μm (平均60 μm) |
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| 孔径 | 800 Å | |
| pH稳定范围 | 基础填料Polar MC-CA Excel：1-13 | |
| 金属离子螯合填料 Polar MC-Ni Excel：1-13 | ||
| 载量 | Polar MC30-CA Excel | >120 μeq. carboxylic group /mL |
| Polar MC30-Ni Excel | 40-60 μeq.Ni++ /mL | |
| Polar MC60-CA Excel | >100 μeq. carboxylic group /mL | |
| Polar MC60-Ni Excel | 40-60 μeq.Ni++ /mL | |
| 组氨酸标记蛋白(His-protein)载量 | Polar MC30-Ni Excel, ~20 mg/mL Polar MC60-Ni Excel, ~15 mg/mL |
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| 操作温度 | ≤40 °C | |
| 操作压力 | ≤30 MPa (30 bar) | |
| 流动相兼容性 | 水溶液，或水和乙腈、丙酮或甲醇的混合物。 常用缓冲液：磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和醋酸盐，也与6M盐酸胍、8M尿素、0.1 M EDTA、10 mM DTT相容 |
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| 线性流速 | ≤1800 cm/h | |
将 300 mL 组氨酸标记蛋白粗品上样到以 PolarMC60-Ni Excel 装填 15x220 mm 比较正规的足球外围appGenerik FPLC柱(货号202000-1525-AF)中。用上样缓冲液清洗后，靶蛋白用含0.5 M咪唑的25 mM磷酸钠缓冲液（pH8），以 7.5 mL/min 的流速洗脱（图 2）。
上样：溶解在25 mM磷酸盐(pH8) + 0.5M氯化钠缓冲液的组氨酸标记蛋白粗品以5.0 mL/min的流速上样；
淋洗：再用25 mM磷酸盐(pH8) + 0.5 M氯化钠缓冲液洗涤色谱柱；
洗脱：用含0.5 M咪唑的25 mM磷酸盐(pH8) + 0.5 M氯化钠缓冲液洗脱组氨酸标记蛋白， 并收集纯化组分、 淋洗液及上样流穿液。
收集的馏分用10%三甘氨酸SDS-Pages确认（ 图3 ）。
泳道1：分子量阶梯
泳道2：组氨酸标记蛋白粗品
泳道3：样品上样后的流穿液
泳道4：上样后清洗色谱柱的淋洗液
泳道5：洗脱靶蛋白的0.5 M咪唑洗脱液
IMAC 填料在 90 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液清洗后表现出耐碱性和可重复使用性 ( 图 4）。用0.5 M NaOH 溶液以 0.25 倍柱体积 /min 的流速进行 30 次循环洗涤,总接触时间为 2 小时后,重复使用该填料纯化相同的组氨酸标记蛋白,结果表 明填料的结合性能保持不变。
泳道 1：分子量阶梯
泳道 2：组氨酸标记蛋白粗品
泳道 3：收集的流穿液作为样品上样到新色谱柱上
泳道 4：用新镍柱洗脱靶蛋白的洗脱液
泳道 5：用 30 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液以 0.25 柱体积 /min 的流速清洗，总接触时间达 2 小时后，收集到的流穿液
泳道 6：用 30 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液清洗镍柱后，靶蛋白的洗脱液
泳道 7：用 60 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液以 0.25 柱体积 /min 的流速清洗，总接触时间达 4 小时后，收集到的流穿液
泳道 8：用 60 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液清洗镍柱后，靶蛋白的洗脱液
泳道 9：用 90 倍柱体积的 0.5 M NaOH 钠溶液以 0.25 柱体积/min 的流速清洗，总接触时间达 6 小时后，收集到的流穿液泳道 10：用 90 倍柱体积的 0.5 M NaOH 钠溶液清洗镍柱后，靶蛋白的洗脱液
| 填料种类 | 粒径 | 货号 |
|---|---|---|
| Polar MC30-CA Excel | 30 μm | 270530800 |
| Polar MC30-Ni Excel | 30 μm | 270630800 |
| Polar MC60-CA Excel | 60 μm | 270560800 |
| Polar MC60-Ni Excel | 60 μm | 270660800 |
预装柱规格为1、4.2、5 mL，包装规格为5 L以下及5 L、10 L、50 L
