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  • Polar MC IMAC 亲和填料

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      Polar MC-IMAC 填料是一种金属亲和填料,适用于纯化带有组氨酸 ( His ) 标签的重组蛋白,这类重组蛋白广泛应用于生物技术领域。该填料以亲水性聚甲基丙烯酸酯微球为基质,粒径为 30 μm 或 60 μm,孔径为 800 Å,具有较高的物理和化学稳定性。填料表面具 有高度的亲水性,最大程度地避免了与生物类样品的非特异性吸附。在亲水性表面,以专有连接物链接了能螯合多价金属离子的羧酸基团。

      Polar MC-IMAC 填料有两种类型 : 游离酸型(Polar MC30-CA Excel 或 Polar MC60-CA Excel,羧酸 ) 和螯合镍离子型 ( Polar MC30-Ni Excel 或Polar MC60-NiExcel)。游离酸型可用于金属离子去除,也可根据客户要求定制他金属离子型填料。这两种类 型的 IMAC 填料结构如图 1 所示。

    填料结构

    图1a. Polar MC30/60-CA Excel的化学结构

    1.png

    图1b. Polar MC30/60-Ni Excel的化学结构

    2.png

      该填料高度稳定,可耐受 0.5 M NaOH 接近 100次清洗循环。螯合金属离子的填料能在 0.1 M 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的清洗条件下不损失金属离子,因此每次使用后无需再补充金属离子。这两种填料都可以散装、 FPLC 柱或常规 HPLC 柱的形式提供。

    技术参数
    填料类型 Polar MC30-CA Excel, Polar MC30-Ni Excel
    Polar MC60-CA Excel, Polar MC60-Ni Excel
    包装条件 50%(v/v)悬浮液,在20%乙醇中保存
    基体 亲水性聚甲基丙烯酸酯
    粒径 20 ~ 45 μm (平均30 μm)
    45 ~ 90 μm (平均60 μm)
    孔径 800 Å
    pH稳定范围  基础填料Polar MC-CA Excel:1-13
    金属离子螯合填料 Polar MC-Ni Excel:1-13
    载量 Polar MC30-CA Excel >120 μeq. carboxylic group /mL
    Polar MC30-Ni Excel 40-60 μeq.Ni++ /mL
    Polar MC60-CA Excel >100 μeq. carboxylic group /mL
    Polar MC60-Ni Excel 40-60 μeq.Ni++ /mL
    组氨酸标记蛋白(His-protein)载量 Polar MC30-Ni Excel, ~20 mg/mL
    Polar MC60-Ni Excel, ~15 mg/mL
    操作温度 ≤40 °C
    操作压力 ≤30 MPa (30 bar)
    流动相兼容性 水溶液,或水和乙腈、丙酮或甲醇的混合物。
    常用缓冲液:磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和醋酸盐,也与6M盐酸胍、8M尿素、0.1 M EDTA、10 mM DTT相容
    线性流速 ≤1800 cm/h

    应用案例

      将 300 mL 组氨酸标记蛋白粗品上样到以 PolarMC60-Ni Excel 装填 15x220 mm 比较正规的足球外围appGenerik FPLC柱(货号202000-1525-AF)中。用上样缓冲液清洗后,靶蛋白用含0.5 M咪唑的25 mM磷酸钠缓冲液(pH8),以 7.5 mL/min 的流速洗脱(图 2)。

    2.jpg

    图2. 组氨酸标记蛋白在Polar MC60-Ni Excel上的纯化实例

    上样:溶解在25 mM磷酸盐(pH8) + 0.5M氯化钠缓冲液的组氨酸标记蛋白粗品以5.0 mL/min的流速上样;

    淋洗:再用25 mM磷酸盐(pH8) + 0.5 M氯化钠缓冲液洗涤色谱柱;

    洗脱:用含0.5 M咪唑的25 mM磷酸盐(pH8) + 0.5 M氯化钠缓冲液洗脱组氨酸标记蛋白, 并收集纯化组分、 淋洗液及上样流穿液。

      收集的馏分用10%三甘氨酸SDS-Pages确认( 图3 )。

    2.jpg

    图3. SDS-Pages分析从图2所示纯化中收集的组分

    泳道1:分子量阶梯

    泳道2:组氨酸标记蛋白粗品

    泳道3:样品上样后的流穿液

    泳道4:上样后清洗色谱柱的淋洗液

    泳道5:洗脱靶蛋白的0.5 M咪唑洗脱液

      IMAC 填料在 90 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液清洗后表现出耐碱性和可重复使用性 ( 图 4)。用0.5 M NaOH 溶液以 0.25 倍柱体积 /min 的流速进行 30 次循环洗涤,总接触时间为 2 小时后,重复使用该填料纯化相同的组氨酸标记蛋白,结果表 明填料的结合性能保持不变。

    2.jpg

    图4. 耐碱性和可重复使用性实验

    泳道 1:分子量阶梯

    泳道 2:组氨酸标记蛋白粗品

    泳道 3:收集的流穿液作为样品上样到新色谱柱上

    泳道 4:用新镍柱洗脱靶蛋白的洗脱液

    泳道 5:用 30 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液以 0.25 柱体积 /min 的流速清洗,总接触时间达 2 小时后,收集到的流穿液

    泳道 6:用 30 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液清洗镍柱后,靶蛋白的洗脱液

    泳道 7:用 60 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液以 0.25 柱体积 /min 的流速清洗,总接触时间达 4 小时后,收集到的流穿液

    泳道 8:用 60 倍柱体积的 0.5 M NaOH 溶液清洗镍柱后,靶蛋白的洗脱液

    泳道 9:用 90 倍柱体积的 0.5 M NaOH 钠溶液以 0.25 柱体积/min 的流速清洗,总接触时间达 6 小时后,收集到的流穿液泳道 10:用 90 倍柱体积的 0.5 M NaOH 钠溶液清洗镍柱后,靶蛋白的洗脱液

    应用图谱

    填料种类 粒径 货号
    Polar MC30-CA Excel 30 μm 270530800
    Polar MC30-Ni Excel 30 μm 270630800
    Polar MC60-CA Excel 60 μm 270560800
    Polar MC60-Ni Excel 60 μm 270660800

    预装柱规格为1、4.2、5 mL,包装规格为5 L以下及5 L、10 L、50 L

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